Il monitoraggio del calcio intracellulare è fondamentale per comprendere i meccanismi di segnalazione cellulare e studiare l’attività neuronale. Gli indicatori genetici fluorescenti del calcio (GECI) sono ampiamente utilizzati nella ricerca biomedica, ma richiedono luce di eccitazione, che può provocare fotobleaching, autofluorescenza e fototossicità.
Per superare questi limiti, i ricercatori hanno sviluppato CaBLAM (calcium bioluminescence activity monitor), un indicatore genetico bioluminescente progettato per rilevare le variazioni del calcio intracellulare con un contrasto elevato, senza necessità di illuminazione esterna. I risultati dello studio mostrano il potenziale di questa tecnologia nell’imaging di cellule, neuroni e animali vivi.
CaBLAM: come funziona il sensore bioluminescente
A differenza degli indicatori fluorescenti, che necessitano di luce per essere eccitati, i sensori bioluminescenti producono luce attraverso una reazione enzimatica. Il loro utilizzo, tuttavia, è stato finora limitato da un contrasto ridotto e da un’affinità per il calcio non sempre adeguata alle concentrazioni fisiologiche.
CaBLAM è stato sviluppato a partire da SSLuc, una variante ingegnerizzata della luciferasi di Oplophorus gracilirostris. Attraverso modifiche mirate alla struttura della proteina e l’inserimento di domini sensibili al calcio, i ricercatori hanno ottimizzato la risposta del sensore alle variazioni della concentrazione intracellulare dello ione.
Nei test in vitro, CaBLAM ha raggiunto un contrasto di circa 83 volte tra condizioni di calcio saturante e assenza di calcio, con una costante di dissociazione di circa 439 nanomoli. Queste caratteristiche permettono di rilevare variazioni del calcio nell’intervallo fisiologicamente rilevante.
Elevato contrasto nelle cellule e nei neuroni
Le prestazioni del sensore sono state valutate in diverse linee cellulari e in neuroni primari, confrontandolo con altri indicatori bioluminescenti. Nelle cellule HeLa, le oscillazioni della bioluminescenza indotte dall’istamina sono risultate circa 3,3 volte maggiori. Nei neuroni corticali primari di ratto, la depolarizzazione indotta dal KCl ha prodotto un aumento della bioluminescenza di circa 20 volte, rispetto a circa 4 volte con l’indicatore di confronto.
Il basso segnale basale contribuisce a distinguere con maggiore efficacia le variazioni del calcio dal fondo. Un contrasto elevato, tuttavia, non significa necessariamente una maggiore luminosità assoluta: nelle cellule HeLa, la luminosità per molecola di CaBLAM è risultata pari a circa il 40% di quella di GeNL(Ca²⁺)₄₈₀.
Monitorare l’attività neuronale in tempo reale
I ricercatori hanno confrontato CaBLAM con l’indicatore fluorescente GCaMP8s in neuroni ippocampali di ratto sottoposti a stimolazione elettrica. CaBLAM è riuscito a rilevare risposte associate anche a un singolo potenziale d’azione evocato, con acquisizioni a 10 fotogrammi al secondo.
Il sensore bioluminescente ha mostrato variazioni relative del segnale elevate, ma una cinetica più lenta rispetto a GCaMP8s. Quest’ultimo ha raggiunto il picco della risposta in circa 100 millisecondi dopo uno o cinque impulsi, mentre CaBLAM ha mostrato tempi mediani di circa 700 e 800 millisecondi, rispettivamente, nelle condizioni sperimentali descritte.
Nelle colture neuronali, GCaMP8s ha inoltre mantenuto un rapporto segnale-rumore di picco superiore. I risultati evidenziano quindi caratteristiche complementari: CaBLAM offre un contrasto elevato, mentre gli indicatori fluorescenti conservano vantaggi in termini di luminosità e velocità di risposta.
Imaging cerebrale nei topi svegli e registrazioni prolungate
Lo studio ha valutato CaBLAM anche nel cervello di topi svegli, confrontandolo con GCaMP6s durante la stimolazione tattile delle vibrisse. Entrambi gli indicatori hanno permesso di rilevare l’attività di singoli neuroni.
In questo contesto, CaBLAM ha mostrato un rapporto segnale-rumore superiore nelle singole prove, grazie soprattutto a un segnale basale più stabile e a un rumore di fondo inferiore. La latenza delle risposte è risultata tuttavia maggiore rispetto a quella dell’indicatore fluorescente.
Un risultato rilevante riguarda la durata dell’imaging. Dopo l’applicazione diretta del substrato sulla corteccia esposta, i ricercatori hanno registrato segnali bioluminescenti per oltre cinque ore, con acquisizioni a 10 fotogrammi al secondo. Le risposte agli stimoli sono rimaste stabili e il rapporto segnale-rumore non ha mostrato differenze significative tra gli intervalli temporali analizzati.
Questa possibilità rappresenta un vantaggio per gli studi prolungati, nei quali fotobleaching e fototossicità possono compromettere le osservazioni basate sulla fluorescenza. La durata delle registrazioni dipende comunque dalla disponibilità del substrato necessario alla reazione bioluminescente.
Le applicazioni nel pesce zebra e le prospettive future
CaBLAM è stato utilizzato anche in larve di pesce zebra per monitorare l’attività di neuroni e astrociti in relazione ai movimenti della coda. Gli esperimenti hanno evidenziato aumenti della bioluminescenza associati ai movimenti più ampi, con risposte di durata e cinetica differenti a seconda delle popolazioni cellulari esaminate.
L’utilizzo di diverse telecamere ha inoltre dimostrato la possibilità di rilevare il segnale con acquisizioni fino a 20 fotogrammi al secondo mediante una telecamera intensificata. Restano aperte alcune sfide, tra cui il miglioramento della luminosità, l’ottimizzazione della velocità di risposta e l’aumento della disponibilità del substrato nei tessuti. I ricercatori indicano inoltre lo sviluppo di varianti con emissione spostata verso il rosso come una possibile direzione futura.
CaBLAM si propone quindi come uno strumento complementare agli indicatori fluorescenti: la capacità di rilevare il calcio intracellulare senza illuminazione di eccitazione, con contrasto elevato e possibilità di imaging prolungato, apre nuove prospettive per lo studio dell’attività cellulare e delle dinamiche neuronali.
